荧光素酶报告基因实验

2024-01-23 15:37:03

荧光素酶报告基因实验

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摘要：双荧光素酶报告基因通常以萤火中荧光素酶为报告基因,以海肾荧光素酶为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范压广、应用灵活等优势,广泛应用于基因调控、非编码 RNA 靶向互作等研究领域。

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双萤光素酶实验的原理

　　将目的基因转录调控原件构建入带有荧光素酶(Firefly luciferase)的表达载体，构建成报告基因质粒，使这段序列(luciferin)，luciferase 可催化 luciferin 发出荧光(波长在 560nm 左右)。检测得到的荧光值高低可以判断不同处理组对该转录调控原件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率差异所造成的误差，通常会转入 Renilla luciferase

萤光素酶实验具体有哪些应用?

　　1、验证 microRNA 同 mRNA 靶向互作。将待测基因的 3'UTR 序列插入报告基因载体，再共转入该 microRNA，检测荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。

　　2、验证 microRNA 同 IncRNA 靶向互作。将待测 IncRNA 序列插入报告基因载体的 3'UTR 区域，检测荧光素酶活性。

　　3、启动子结构分析。将启动子区域(约 2k 左右)进行分段截短或突变，构建入报告基因载体，检测荧光素酶活性。

　　4、启动子 SNP 分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。

　　5、验证信号通路是否激活。将该信号通路的下游相应原件序列构建入报告基因载体，检测不同上游条件下，其荧光素酶活性，即下游信号通路的响应情况。

双萤光素酶实验的具体步骤

　　1、报告基因质粒的构建。将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上，如 pGL3-basic。

　　2、转染细胞。将报告基因质粒和 ph RL-TK (内参) 共转染细胞，根据需要对细胞进行处理。共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为 10：1~50：1。

Luciferase 活性测定：

　　1、初次使用时，配制 LARII，即 Firefly luciferase 的底物。将 LAR II 溶解在 LAR II buffer 中，并分装-80℃避光保存。

　　2、加入 1XPLB，室温裂解细胞 15min。

　　3、配制 Stop&Glo，即 Renilla luciferase 的底物，能够终止 LARII 的反应。

　　4、测定荧光值。向 40ul 的 LARII 中加入 10ul 细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为 Firefly luciferase 的值。加入 40 ul Stop&Glo，再次读数，即为 Renilla luciferase 的值。

　　5、数据处理。首先计算出每管的 Firefly luciferase/Renilla luciferase 的比值，再以 control 组的比值为单位 1，即可得到不同处理组的相对 luciferase 活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。

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