眼科疾病模型实验

眼科疾病模型实验 - 造模类型

　　glaucoma模型 - 小鼠、眼角膜碱伤模型 - 小鼠、干眼症模型 - 小鼠、葡萄膜炎模型 - 小鼠、Diabetes Retinopathy - 兔等
　　实验方法及步骤：

　　人或动物体内(或胚胎)的组织，将其剪碎至1mm3的组织块，再采用如下方法进行原代细胞分离培养：

　　一、悬浮细胞的分离方法

　　1.将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。

　　2.去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。

　　3.用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。

　　4.如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液获得目的细胞。

　　二、实体组织材料的分离方法

　　1、机械分散法

　　(1)纤维成分很少的脑组织，个别胚胎组织，用剪刀剪碎至1mm3的组织块。

　　(2)用PBS清洗两次后

　　① 用吸管吹打，分散组织细胞。

　　② 或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出。

　　③ 或在不锈钢纱网内用钝物(注射器钝端)压挤使细胞从网孔中压挤出。

　　(3)将细胞转入离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。

　　(4)去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。

　　2、消化分离法

　　(1)酶消化分离法(过夜冷消化法)

　　① 细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。

　　② 再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。

　　③ 加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。

　　④ 次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2-3次。

　　⑤ 加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。

　　(2)非酶消化法(EDTA消化法)

　　① 把组织块剪碎，呈1mm3大小的组织块。

　　② 将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。

　　③ 加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次)，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。

　　④ 弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤2-3次后，加入完全培养基。

　　⑤ 用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。

　　3、原代细胞培养

　　原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖增加有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的tumour细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗ai药物的筛选，根据zl细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择有效的化疗方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。

　　4、原代细胞的传代、保存

　　(1)传代：依椐细胞的生长状态，生长的细胞1：2或1：3进行传代。

　　(2)保存：DMSO+培养液+血清

　　按下列顺序降温：室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→超低温冰箱(-80℃ 过夜)→液氮。

　　5、原代细胞的复苏

　　(1)取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。

　　(2)吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。

　　(3)用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃ CO2 培养箱静置培养。

　　6、个别实验结果：

　　(1)成骨细胞诱导

　　(2)大鼠脂肪干细胞

　　(3)骨髓间充质干细胞

　　(4)人腰椎软骨细胞原代

我们的承诺

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